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摘要：旨在研究猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，简称Mhp）纤毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白（flagellin，简称F）-霍乱毒素B亚基（cholera toxin B subunit，简称CTB）2种重组蛋白对口蹄疫（foot-and-mouth disease，简称FMD）灭活疫苗的免疫增强作用。通过体外表达获得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1 2种重组蛋白，用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）方法检测pCold-F7-CTB蛋白的生物學活性，将重组蛋白分别与口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，简称FMDV）灭活抗原、口蹄疫灭活疫苗混合制备，皮下或腹腔接种Balb/c小鼠，共免疫2次，间隔3周。分别于免疫前、免疫后21、35、49 d采血，49 d后无菌摘取脾脏。采用阻断ELISA的方法检测小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白（IgG）抗体滴度，用流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例，以评估免疫效力。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析结果表明，2种重组蛋白成功表达。用GMl（神经节苷脂）-ELISA方法验证pCold-F7-CTB的生物学活性，发现融合蛋白F7-CTB保留了与GMl的结合能力。小鼠免疫试验结果表明，经皮下注射接种后，单独口蹄疫病毒灭活抗原组没有产生明显的抗体水平，而F7-CTB免疫增强剂组比单独口蹄疫病毒灭活抗原组的IgG滴度更高。在试验中发现，当重组蛋白与口蹄疫灭活疫苗联合使用时，血清中的IgG滴度明显增高，CD3+CD8+T淋巴细胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果最佳。可以初步得出，免疫增强剂P97和F7-CTB具有协同作用，皮下注射可显著提高FMD的特异性IgG水平，CD3+CD8+T淋巴细胞比值升高，显示其具有良好的应用前景。
关键词：口蹄疫;P97;F7-CTB;免疫增强剂
中图分类号： S855.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）11-0204-06
口蹄疫（foot and mouth disease，简称FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，简称FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病之一[1]。疫苗接种是预防和控制口蹄疫最可靠和有效的手段[2]。目前灭活口蹄疫疫苗的使用仍最为广泛[3-4]。现有的口蹄疫疫苗存在免疫后抗体产生慢、抗体水平低和持续期短的缺点[5]，因此，本研究以增强免疫效力为目的，尝试研制一种新型免疫增强剂。
结合猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，简称Mhp）的免疫学特点，R1区作为Mhp纤毛黏附因子p97黏附纤毛的主要决定区，主要引起黏膜免疫和细胞免疫[6]。同时也是少数被证明具备免疫保护能力的抗原之一[7-8]。鞭毛蛋白作为 TLR-5受体激动剂，能诱导强烈、广泛的免疫反应[9]。
鞭毛蛋白（flagellin，简称F）佐剂的效果在流感病毒[10-11]、结核分枝杆菌[12]和鼠疫菌[13]的研究中已经被多次确认，鞭毛蛋白是较好的载体及佐剂。Albert等在研制亚单位疫苗时，将结肠弯曲菌的鞭毛蛋白的FlaA片段与麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，简称MBP）进行融合表达，得到了MBP-F1aA重组蛋白，通过口服途径免疫，结果显示，对照组小鼠肠道的细菌完全定植，MBP-F1aA免疫组有71.4%的小鼠有细菌定植，显示该重组蛋白在一定程度上抵御了结肠弯曲菌的感染[14]。Delaney等用flagellin-L1R（FR）重组蛋白（将牛痘病毒L1R抗原序列连到细菌鞭毛蛋白N端）免疫小鼠，结果能产生与天然L1R相互作用的抗体，FR重组蛋白更能促进抗原特异免疫球蛋白（IgG）的产生，加强免疫后可产生有效的保护性免疫应答，对小鼠能提供100%的保护[15]。大肠杆菌霍乱毒素（CT）具有黏膜免疫佐剂活性，是细菌类毒素，研究发现，CT的B亚单位单独作用，表现为无毒性，但仍可保持较强的佐剂活性，能刺激机体产生强烈的黏膜系统免疫应答，调节Th1、Th2型细胞反应的细胞因子的表达[16]。Hou等将霍乱毒素B亚基（cholera toxin B subunit，简称CTB）作为黏膜佐剂，与HIV-1DNA（人免疫缺陷病毒-1的DNA）疫苗联合后免疫小鼠，可诱导其产生高水平的Thl和Th2型细胞因子、炎症细胞因子和趋化因子，同时提高血清中Env蛋白的IgG抗体水平[17]。Miyata等将CTB与蛋白MSP1-19耦合，可以提高血清和支气管肺泡灌洗液中的IgG抗体水平[18]。由以上结果可以看出，CTB无论是作为黏膜免疫佐剂还是抗原递送载体，都有良好的免疫增强作用。本研究将F7和CTB基因进行连接后重组表达，并与P97重组蛋白联合或分别单独作用，从体液免疫及细胞免疫角度来评估其免疫应答，以期改善传统疫苗的缺点。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
PCold Ⅰ-F7、pUC57-CTB质粒均由由农业部兽用生物制品工程技术重点实验室保存;pET32a-P97-R1由江苏省农业科学院兽医研究所猪病研究室惠赠;大肠杆菌感受态细胞Trans5α和BL21（DE3），购自TransGen公司。
1.2 主要试剂
限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、Sal Ⅰ、Xba Ⅰ和T4 DNA连接酶，购自TaKaRa公司;蛋白纯化试剂盒，购自GE公司;辣根过氧化物酶（HRP）-小鼠抗组氨酸（histidine，简称His）标签、HRP-羊抗鼠-IgG和HRP-羊抗兔-IgG，购自博士德生物工程有限公司;CTB蛋白、兔源抗大肠杆菌不耐热性肠毒素（Heat-labile enterotoxin B subunit，简称LTB）抗体、神经节苷脂1（Ganglioside，简称GM1）和胎牛血清，购自Sigma公司;PE-CyTM7 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti -Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD8a，购自美国BD公司;单组分3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-Tetra-methylbenzidine，简称TMB）显色液Ⅰ、无血清培养基RPM 1640、Triton x-114，购自南京助研生物技术有限公司;MONTANIDE ISA 206 VG，购自赛彼科（上海）特殊化学品有限公司;内毒素检测试剂盒，购自Thermo公司;口蹄疫O型液相阻断酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）抗体检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。