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摘要：为了查明监利县某鸭场产蛋鸭突然死亡的病因，对样品进行细菌分离、生化鉴定、PCR扩增鉴定、致病性试验及药敏试验。结果表明，分离菌与多杀性巴氏杆菌同源性达99.88%，分离菌的荚膜抗原血清型特异性基因PCR产物与荚膜血清A型基因同源性达99.90%，确定病原菌为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌;该菌株对大观霉素高度敏感，对阿米卡星、新霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，对头孢曲松、链霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、氟苯尼考、四环素、呋喃妥因、洁霉素等具有耐药性。
关键词：多杀性巴氏杆菌;荚膜血清A型;PCR鉴定;药敏试验
中图分类号：S834+.8 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2019）12-0116-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.027 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： In order to elucidate the cause of sudden death of laying-duck in a duck farm in Jianli， which the pathogen was determined to be capsular serotype A Pasteurella multocida by bacterial isolation，biochemical identification，mouse pathogenicity test and PCR amplification. The results showed that the isolate had 99.88% homology with Pasteurella multocida， and the PCR product of the capsular antigen serotype-specific gene of the isolate was 99.90% homologous with the Capsular Serotype A， and the pathogen was determined to be Pasteurella multocida strains belonged to capsular serotype A. In order to investigate the drug resistance， the results of drug susceptibility test showed the pathogen was highly sensitive to spectinomycin， moderately sensitive to amikacin， neomycin， norfloxacin， ofloxacin， clindamycin， azithromycin， while resistance to ceftriaxone， streptomycin， co-trimoxazole， sulfisoxazole， fluoride benignic， tetracycline， nitrofurantoin， lincomycin， which provided guidance for clinical rational medication.
Key words： Pasteurella mutocida; capsular serotype A; PCR identification; drug-sensitivity test
多殺性巴氏杆菌（Pasteurella mutocida）可引起鸭巴氏杆菌病（又称鸭霍乱），该病是一种急性、败血性、高度接触性传染病，产蛋鸭的发病率较高。常呈现急性败血症过程，急性型发病率和死亡率可高达80%～90%，也见慢性或良性经过。呈世界性分布，是严重危害养禽业的重要细菌性传染病之一;在同种禽间传染快，在异种禽间可传染，猪及人类也可携带病菌。带菌的表面健康禽只，在饲养管理不当（如断料、断水或突然改变饲料），季节交替、气候突变等应激条件下，动物机体抵抗力下降时，易发生内源性传染而发病，呈地方性流行[1]。由于多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可以分为5种血清型，即A、B、D、E和F型，且不同血清型之间交叉免疫保护力较差，目前国内家禽中主要流行的是A型[2]，因此对病原鉴定时有必要鉴定其血清型，为分子流行病学调查和疫苗候选株的选择提供试验依据。
随着集约化、放牧式养鸭的迅速发展，鸭巴氏杆菌病发病率呈上升趋势，造成的危害越来越严重。虽然抗生素对于鸭霍乱的防治具有一定的疗效，但普遍存在着停药后容易复发的缺点，同时长期用药及滥用导致细菌的耐药性日趋严重，因此，对地方分离菌株进行药敏试验，对临床合理用药具有重要的指导作用。本研究通过细菌分离培养、生化鉴定、小鼠致病性试验、PCR种属及分型鉴定，确定病原菌为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌，药敏试验结果为该分离菌株对大观霉素、诺氟沙星等药物敏感，可为临床合理用药提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源 2018年1月湖北省监利县某鸭场260日龄的产蛋鸭，发病呈急性经过，用氟苯尼考等抗生素治疗，无明显效果。剖检发现，心包膜增厚、出血，肝脏肿大、表面有灰白色小点，脾脏肿大出血，各段肠黏膜出血。无菌采集心脏、肝脏等组织，保存备用。
1.1.2 培养基及试剂培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、麦康凯琼脂培养基（MAC）、水解酪蛋白培养基（MH）、小牛血清等，均购自武汉洁洋盛科技有限公司;小量液体样品核酸抽提试剂盒，购自上海华舜生物技术有限公司;药敏试验质控标准菌株，大肠杆菌CMCC 44102，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心;抗菌药物纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.3 试验小鼠 昆明小鼠，体重为18～20 g，购自湖北省疾病预防控制中心。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离纯化 取无菌采集的病变组织同时涂抹在含5%小牛血清TSA和MAC平板上，并划线，置于37 ℃恒温箱内培养18～24 h。观察菌落形态，挑取典型菌落革兰氏染色、镜检，同时划线接种含5%小牛血清TSA平板纯化培养。
1.2.2 生化鉴定 对分离的病原菌株按常规方法进行生化试验[3]。将所获得分离菌的纯培养菌落1～2个，分别接种于各微量生化发酵管内，置37 ℃培养24～48 h，定时检查反应结果。
1.2.3 PCR扩增鉴定
1）PCR引物合成。挑取TSA平板上纯化菌落，提取细菌基因组作DNA模板，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成细菌16S rRNA通用引物，上游引物P1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，下游引物P2：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′;参照Townsend等[4]合成多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F荚膜血清型特异性基因引物capA、capB、capD、capE、capF。
2）PCR扩增。种属特异性PCR 20 μL反应体系：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）10 μL，无菌水8 μL，上、下游引物各1 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环;72 ℃延伸7 min。分型使用mPCR 方法，反应条件与种属特异性 PCR 反应条件一致。
1.2.4 致病性试验 挑取纯化的单个菌落接种于含5%小牛血清的TSB，37 ℃摇床培养12～18 h;采用表面培养测定法进行活菌计数，然后稀释为2×108 CFU/mL。试验分为2组：试验组5只小鼠，每只腹腔注射菌液0.2 mL;对照组2只，每只腹腔注射无菌TSB 0.2 mL。观察、记录小鼠发病与死亡情况。死亡小鼠立即剖检，观察病变并进行病原菌的分离鉴定。
1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散（K-B）法进行[5]。将分离菌的纯培养物均匀涂布于MH培养基平板上，贴上15种药敏纸片：大观霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢曲松、阿米卡星、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、链霉素、氟苯尼考、呋喃妥因、磺胺异恶唑、复方新诺明、四环素、洁霉素，37 ℃培养24 h后观察，量取抑菌圈的直径，结果的判定按照抗微生物药物敏感性试验执行标准（CLSI）2010版。
2 结果与分析
2.1 细菌分离纯化
细菌在TSA平板上可见有单个灰白色、圆形、湿润、针尖大小的菌落，革兰氏染色镜检为阴性球杆菌，且成对排列;而在MAC平板上无菌生长。
2.2 生化鉴定
葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、硫化氢、硝酸盐还原为阳性，木糖、山梨醇、麦芽糖、棉子糖、鼠李糖、乳糖、卫矛醇、尿素酶、乙酰甲基甲醇试验（V-P）为阴性，符合多杀性巴氏杆菌特有的生化特征。
2.3 PCR扩增鉴定
在460 bp处得到预期的目的条带（图1），将PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在GenBank中进行同源性比对，与多杀性巴氏杆菌同源性达99.88%。PCR检测A、B、D、E、F荚膜血清型特异性基因，结果仅capA引物扩增出了目的片段（1 044 bp），经测序比对与荚膜血清A型的特异性基因（hyaD-hyaC）同源性达99.90%，其他引物对均未获得扩增片段。
根据分菌菌株的培养特性、形态特征和16 S rRNA序列比对及PCR分型鉴定结果，确定该分离菌株为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌。
2.4 致病性试验
试验组的5只小鼠接种后8 h，均出现精神萎靡、食欲减退、腹泻等症状，随后在24～48 h内全部陆续死亡;而对照组2只小鼠无发病和死亡，全部健康。无菌采取死亡小鼠心血制成涂片后革兰氏染色镜检，同时进行细菌分离培养。镜检可见大量革兰氏阴性球杆菌，在大小、形态特征、排列方式、染色特性上均与初次分离菌株以及接种菌株基本相同。
2.5 药敏试验
从表1中可看出，该菌株对大观霉素高度敏感，对诺氟沙星、氧氟沙星、阿米卡星、新霉素、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，对头孢曲松、链霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、氟苯尼考、四环素、呋喃妥因、洁霉素等耐药。
3 讨论
鸭霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的一种接触性传染病，特点是发病快、发病率和死亡率高，主要通过呼吸道和消化道传染;饲养管理不当和环境恶劣是该病的主要诱因。本研究对一例急性死亡病鸭进行细菌分离，将常规的生化试验与分子生物学鉴定手段相结合，能够快速准确地判断病因，为临床诊断和治疗提供可靠依据。通过荚膜血清型的PCR鉴定，确定其为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌，与文献报道的鸭霍乱病例的血清型一致[6，7]，说明荚膜血清A型仍然是国内家禽中多殺性巴氏杆菌主要流行的血清型。近年来，鸭霍乱的发病率逐渐上升，且性成熟的鸭最易感，而母源性抗体不能起到有效保护作用，利用地方分离菌株制备自价灭活苗有较好的预防效果[8，9]。
为了解发病地区多杀性巴氏杆菌的耐药情况，对分离菌株进行了药敏试验。从药敏试验结果分析发现，耐药情况非常严重，15种抗生素药物中，高度敏感的只有1种药物，高敏率为6.67%（1/15），耐药率达到53.33%（8/15），这与养殖场用药不规范及滥用有关。由于不同地区存在着流行菌株与抗生素使用情况的差异，导致多杀性巴氏杆菌的地区分离菌株耐药性也存在着差异[10，11]，极大地增加了治疗时药物选择的难度，应引起足够重视。
防控鸭霍乱的最有效措施是采取防治结合、防重于治的原则，做好养殖环境的隔离、卫生消毒工作，加强饲养管理，避免潮濕、拥挤、营养缺乏等不良应激因素的影响，增强鸭个体机体抵抗力，积极采取疫苗免疫预防，从而减少或杜绝疾病的发生。早发现、早诊断、及时用药和准确用药也是关键，如果发病初期及时采取药物、疫苗给予控制，并将病鸭隔离，无害化处理死亡鸭，用生石灰水等消毒剂进行场地和器械彻底消毒，则疫情可以得到迅速控制。
参考文献：
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收稿日期：2019-01-03
作者简介：王红琳（1966-），女，江苏海安人，高级兽医师，主要从事畜禽传染病预防及生物制品研发工作，