摘要 研究了气相色谱法快速分析乌贼膏中脂肪酸组成的方法。通过试验比较了索式提取、超声提取和加速溶剂萃取3种方法的提取效率，同时对检测多种脂肪酸甲脂的气相色谱参数进行全面优化，建立了GC快速分析方法。结果表明，加速溶剂萃取法大大缩短了提取时间，提取出来的脂肪酸经三氟化硼-乙醚催化甲脂化，采用Agilent HP-88色谱柱分析，从乌贼膏中共检出23种脂肪酸，均达到基线分离。本方法快速、准确，可用于乌贼膏中脂肪酸组成的定性和定量分析。
关键词 乌贼膏；气相色谱法；脂肪酸组成；甲酯化；快速检测
中图分类号 O657.63 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）01-0283-03
Analysis of Fatty Acids Compositions in Squid Extract by Accelerated Solvent Extraction-Gas Chromatography
LIU You-tian LIAO Jie-liang XIE Shui-qing
（Wuguishan Agricultural Service Center of Zhongshan City in Guangdong Province，Zhongshan Guangdong 528458）
Abstract The study on the rapid analysis of fatty acids compositions in squid extract by gas chromatography（GC）was developed.The extraction rates of fat from squid extract by means of three different extraction methods，including，saxhlet extraction，ultrasonic extraction and accelerated solvent extraction were compared.Meantime by optimizing the simultaneously detection parameters of various fatty acid methyl esters by gas chromatography，a rapid GC analysis method was established.The results showed that，accelerated solvent extraction shorten the extraction time，the methyl esterification of fatty acid extracted from the squid extract by using boron trifluoride etherate as catalyst，and Agilent HP-88 column was used as analytical column，squid extract detected 23 substances，and all reached the baseline separation.The method was rapid and accurate，and it could be used for qualitative and quantitative analysis of fatty acids in squid extract.
Key words squid offal；gas chromatography；fatty acids compositions；methyl esterification；rapid detection
乌贼是我国四大海产（大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼）之一，可以说全身是宝，食用味美，药用效佳。因此，乌贼的渔业捕捞量很大。随着可持续发展和循环经济的理念不断深入，在乌贼的利用上，除了可食药用部分外，其内脏和下脚料也大有用武之地。它们被深加工制成乌贼膏，成为水产饲料中优良的诱食剂和营养补充剂。这是因为乌贼膏的氨基酸组成良好，所含有的氨基酸对鱼虾有非常强烈的诱引作用，并且含有的高度不饱和脂肪酸及胆固醇，是促进虾、蟹消化吸收和生长的不可或缺的营养元素。
随着水产饲料行业的蓬勃发展，乌贼膏的需求量也飞快地增长。但一方面由于其由海洋动物加工后的下脚料制成，因此存在质量不稳定、不同厂家质量差异大等问题。而且随着需求量的增大，掺杂使假等问题也日趋严重；另一方面因其加工及处理方式的不同，乌贼膏的质量差异大，特别是脂肪含量差别很大。优质乌贼膏的脂肪含量应该控制在20%左右。过低，则说明在加工中有损失；过高，则影响蛋白等其他营养指标。乌贼膏的脂肪中富含多种必需脂肪酸，如EPA、DHA等，是动物生长所必需的，且可以提高动物的免疫力。因此，乌贼膏的脂肪含量检测及脂肪酸组分分析对其质量控制尤为重要。
随着营养学研究发展，科研工作者对食品中脂肪酸的组成及其营养价值的研究也日趋关注[1-4]。在气相色谱分析脂肪酸组分的过程中，脂肪的提取是关键，甲酯化处理技术是核心。索氏提取法[5]测定油脂含量是经典的国标方法之一；超声提取法[6]提取油脂可以提高油脂提取率、缩短提油时间、减少溶剂的用量；加速溶剂萃取法[7-8]具有溶剂用量少、萃取时间短、自动化程度高等优点。目前，有关乌贼膏脂肪酸组成的研究尚未见报道，现提出快速溶剂萃取-气相色谱分析乌贼膏中脂肪酸组成的方法，并结合试验结果对乌贼膏的营养价值进行分析。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
气相色谱仪：Agilent 7820A气相色谱仪（FID检测器），G5413A自动进样器。XW-80A涡旋振荡器（上海琪特分析仪器有限公司），SOX406脂肪测定仪（海能公司），ASE100 型快速溶剂萃取仪（美国戴安公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）。
乙醚、正己烷和氢氧化钾均为分析纯（购自广州化学试剂厂）；石油醚：沸程（30～60 ℃和60～90 ℃）（购自广东光华科技股份有限公司）；无水甲醇色谱纯（广东光华科技股份有限公司）；三氟化硼乙醚溶液（美国阿拉丁公司）；脂肪酸40种混合标准品和13种反式脂肪酸混合标准品（上海安谱科学仪器有限公司）；氢氧化钾甲醇溶液：称氢氧化钾22.6 g溶于100 mL无水甲醇中，混合均匀，其浓度为4 moL/L。
对照品的制备：称取脂肪酸40种混合标准品250 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，混匀。置于4 ℃冰箱保存。
1.2 气相色谱条件
色谱柱：HP88 60 m×0.25 mm，升温程序：100 ℃保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持15 min；进样口温度250 ℃；检测器温度：270 ℃；载气为氮气，柱流量：恒流4.0 mL/min。氢气流量：40 mL/min，空气流量：400 mL/min，尾吹流量：45 mL/min。分流比5∶1，进样量1 μL。
1.3 样品前处理方法
1.3.1 粗脂肪抽提。
（1）索氏提取。提取杯在105 ℃烘箱中烘干2 h，冷至室温后，立即称量空杯重量m0。称取样品1.000 g（精确至1 mg），用滤纸包成3 cm×1 cm大小，在105 ℃烘箱中烘干2 h，再将纸包置于脂肪抽提仪的样品框上，再向提取杯中加入25～30 mL提取剂，65 ℃提取4 h后，氮气下挥干溶剂，盛有脂肪的提取杯在105 ℃烘箱中烘干2 h，冷至室温后，立即称量（m1），记录前后质量差（m1-m0），该差值为粗脂肪的量。
（2）超声提取。称取105 ℃下烘干的样品0.1 g，置于25 mL装有20 mL石油醚的具塞试管（105 ℃ 下烘干2 h，冷至室温后，称得质量m3），55 ℃下超声提取1 h 后，氮气下挥干，105 ℃ 烘干0.5 h，冷至室温后，称得试管质量m4，记录前后质量差（m4-m3），该差值为粗脂肪的量。
（3）加速溶剂萃取。称取105 ℃下烘干的样品0.1 g，放入与加速溶剂萃取仪（ASE）配套的34 mL萃取池中萃取，萃取溶剂为石油醚（30～60 ℃）。加速溶剂萃取仪萃取条件：预加热时间5 min；静态萃取时间：5 min；萃取温度55 ℃；冲洗溶剂为萃取溶剂用量的50%；惰性气体吹扫时间60 s。具塞试管在105 ℃烘箱中烘干2 h，冷至室温后，立即称量空管重量m5。将萃取溶液从ASE 的接收瓶转移至圆底烧瓶中，用 15 mL 正己烷分3次润洗接收瓶，润洗溶液全部转移到圆底烧瓶中，旋转蒸发仪旋蒸至近干，转移至10 mL具塞试管中，氮气吹干后，冷至室温后，称得试管质量m6，记录前后质量差（m6-m5），该差值为粗脂肪的量。
1.3.2 供试液的制备。用石油醚将抽提得到的脂肪定容至10 mL，分取2 mL置于带塞比色管中，加入4 moL/L氢氧化钾甲醇溶液0.6 mL，振摇1 min，在加入三氟化硼乙醚溶液2滴，涡旋振荡2 min后，放置20 min，静置分层后，取上清液1 μL进气相色谱测定。
1.3.3 脂肪酸定性与定量。将各种脂肪酸甲酯的混合标准工作液和样品甲酯化后的溶液在相同条件下分别进样，以脂肪酸甲酯的标准样品峰的保留时间进行定性，确定样品中的脂肪酸甲酯的样品峰，用面积百分比法进行定量（不计溶剂峰面积），以确定各种脂肪酸的相对百分含量。
2 结果与分析
2.1 提取方法的选择
乌贼膏的粗脂肪提取直接关系到脂肪酸组成的定量分析结果，其提取效率也影响到脂肪酸分析的效率。本文考察了3种不同提取方法索氏提取、超声提取和加速溶剂萃取对乌贼膏的粗脂肪抽提效率的影响，结果见图1。从图1可以看出，在考察的试验条件下，加速溶剂萃取的提取效率最高，20 min内提取率达到最值，由于高温高压浸提充分，所用的溶剂用量少，提取时间短；超声提取效率次之，1 h后提取率达到最值，但所得萃取液挥干之前需经过滤分离，增加了操作步骤；索氏提取的提取时间最长，试验发现4 h提取率达到最值，且溶剂用量多。本文采用加速溶剂萃取的方法提取乌贼膏中的脂肪。
2.2 不同酯化方法的比较
脂肪酸由于沸点较高，不易汽化，在进入气相色谱前需进行衍生化反应，生成相应的甲酯化物后方能用气相色谱分析。甲酯化的关键在于能否全部酯化，或酯化过程中会不会分解，或生成其他物质。因此，选择方便、快捷的甲脂化方法对脂肪酸的分析至关重要。目前，油脂常用的甲酯化方法有三氟化硼-甲醇法、硫酸-甲醇法[9]、氢氧化钾-甲醇法[10]等。每种方法各有其优缺点，且使用范围各不相同。硫酸-甲醇法和氢氧化钾-甲醇法所需的反应时间长于三氟化硼-甲醇法，本文考虑到时间的因素，选择三氟化硼催化，氢氧化钾-甲醇法来酯化样品。试验结果显示，2 min内酯化反应完成，简化了反应步骤，提高了反应效率，节省了分析时间，适用于快速分析的要求。
2.3 色谱柱的选择
对于气相色谱分析，色谱柱选择是分析的关键。按极性的不同，色谱柱可分为非极性、弱极性、中等极性和极性。同种样品在不同极性的色谱柱上会表现出不同的色谱动力学行为而引起分析数据出现差异。本试验选用非极性HP-5柱、极性HP-INNOWax柱和强极性HP-88 柱对 40 种脂肪酸甲酯混标样品进行分离。结果表明：40种脂肪酸标准未能在HP-5和HP-INNOWax色谱柱全部出峰，HP-5 柱对40种脂肪酸混标的检测结果共有 35 个峰，HP-INNOWax 柱检测出 34 个峰，唯有在HP-88 柱上共检测到 40个峰，除第21#和 22#和30#和31#峰外，其余峰均达到基本分离。经 GC-MS 定性得到各个峰的物质名称及其出峰顺序见图2。样品色谱图见图3。
2.4 乌贼膏样品中脂肪酸组成与含量
从表1可以看出，乌贼膏中脂肪至少含有 23 种脂肪酸，多由C14～C22的长链脂肪酸组成，其中饱和脂肪酸8种，不饱和脂肪酸 15 种。乌贼膏中饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的比例为SFA∶MUFA∶PUFA= 27.7∶21.7∶50.6≈1.3∶1.0∶2.3，与乌贼肌肉中比例略有不同[11]，但3类脂肪酸的大小顺序相同。乌贼膏的多不饱和脂肪酸（PUFA）含量为 50.6%，与绝大多数乌贼肌肉相当。其中含量最高的饱和脂肪酸是棕榈酸，单不饱和脂肪酸是油酸，DHA和 EPA 的含量分别占多不饱和脂肪酸第1位和第3位，DHA所占比例高达25%，试验数据显示乌贼膏中含丰富的不饱和脂肪酸。众所周知，所有的脊椎动物都不能直接合成亚油酸（18∶2n-6）、亚麻酸（18∶3n-3）及碳元素更多的n-6和n-3系列不饱和脂肪酸，所以对n-6和n-3族脂肪酸有绝对的饲用需求。研究文献报道[12]，在鱼类营养中，饲用的油脂是鱼类能量和必需脂肪酸（EFA）的来源，也是脂溶性维生素的携带者。而本试验结果显示，乌贼膏中n-3族脂肪酸和n-6族脂肪酸分别占总脂肪的39.5%和9.5%，所占比例大。因此，由试验数据得出，乌贼膏作为饲料添加剂，具有较高的营养价值。
3 结论
本文建立了加速溶剂萃取乌贼膏样品中的脂肪，并以三氟化硼-甲醇法催化甲酯化，以毛细管柱HP-88作为分离柱，气相色谱法快速分析其脂肪酸组成。结果：乌贼膏中粗脂肪含量在20%左右；不饱和脂肪酸含量高，所占总脂肪的比例为72.3%，其富含n-3族脂肪酸和n-6族脂肪酸，作为饲料添加剂，乌贼膏对鱼类及虾类具有较高的营养价值。
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基金项目 中山市科技计划项目（2013A3FC0234）。
收稿日期 2013-12-11