【摘要】 目的 主要研究高剂量电离辐射对松果腺细胞照射后不同时间点的影响。方法 采用流式细胞术检测松果腺细胞凋亡。采用放免分析法，检测松果腺细胞中cAMP含量。采用高效液相色谱分析法，检测松果腺细胞中MLT 含量的变化。结果 ①小鼠受6 GyX射线全身照射后8、48、120、168 h，松果腺细胞凋亡率增加，48 h达到最高。②小鼠受6 GyX射线全身照射后8、48、120、168 h，松果腺细胞中cAMP含量均降低，48 h达到最低。③小鼠受6 GyX射线全身照射后8、48、120、168 h，松果腺细胞合成和分泌MLT 功能减弱，48 h达到最低。结论 高剂量电离辐射对松果腺细胞功能有抑制作用，48 h达到最低。
【关键词】
松果腺；电离辐射；褪黑素；细胞凋亡
Effect after ionizing irradiation on function of pineal gland cells
WANG Feng, AI Yiqin, LI Rongqing.
The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650032, China
【Abstract】 Objective
To research the effects different points of time after ionizing irradiation on function of mouse pinealocytes. Methods The contents of cAMP in mouse pinealocytes were measured with radioimmunoassay. The result MLT pinealocytes measured with high performance liquid chromatography.The percentage of pinealocytes apoptosis in mice was determined with flow cytometry. Results The percentage of pinealocyte apoptosis was observed time point to 8,48,120,168 hours after irradiation with 6 Gy in mice,and was highest 48 hours after irradiation.The content of cAMP in mice pinealocyte reduced time point to 8，48，120，168 hours after irradiation with 6 Gy, and was lowest 48 hours after irradiation. The content of MLT secreted by mouse pinealocytes decreased time point to 8，48，120，168 hours after by irradiation with 6.0 Gy Xrays, and was lowest 48 hours after irradiation. Conclusion High dose ionizing radiation has the inhibiting effect to the fuction of pinealocytes, and was lowest 48 hours after irradiation.
【Key words】
Pinealgland; Melatonin; Ionizing radiation; Apoptosis
作者单位：650032昆明医学院第一附属医院放疗科
近年来随着松果腺研究的不断深入，松果腺对机体重要性越来越受到人们重视，而有关高剂量电离辐射对松果腺功能影响目前报道资料很少。我室以往研究表明，低剂量电离辐射可激活松果腺细胞功能，使松果腺分泌褪黑素(melatonin, MLT)能力增加[1]。本实验在此基础上研究高剂量电离辐射对松果腺细胞照射后不同时间点的影响，为肿瘤头部放疗对松果腺造成的影响提供一个实验依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 试剂 cAMP检测试剂盒(中国科学院原子能研究所)， 褪黑素(Sigma, USA)。
1.1.2 仪器 流式细胞仪(FAScan，BD，USA)， 国产X.SS.250(FZ)型固定式X射线深部治疗机(中国)，Lc6A高效液相色谱仪(日本，岛津)。
1.2 实验动物及处理 昆明小白鼠，雌雄各半，体重(18±2)g， 健康，由吉林大学实验动物部提供。自然光照下饲养3 d后，将小鼠随机分组，每组6~16只，受6.0 GyX射线全身照射。
1.3 照射条件 国产深部X射线治疗机、电压200KV、电流10 mA、滤板0.5 mmCu+1.0 mmAl。
1.4 放免分析法测定cAMP含量 实验动物均于上午8:00~10:00 h断头处死，取下松果腺，迅速置于液氮中，每个样品加入1N高氯酸0.2 ml于玻璃匀浆器中匀浆，1500 rpm离心10 min，取全部上清，用20%的氢氧化钾中和(pH=7.0)，再离心去沉淀，取全部上清液置于24孔板，37℃恒温箱烘干，密封保存。蒸干后的样品溶于120 μl 的TE缓冲液测cAMP的含量。cAMP标准溶液配制及样品检测按试剂盒说明稍加改进操作。
1.5 流式细胞术(FCM)检测松果腺细胞凋亡 实验动物均于上午8:00~10:00 h断头处死，迅速取4只动物松果腺为一个样品置于PBS液中，用毛玻璃研磨成单细胞悬液，200目纲网过滤，去除结缔组织，1500rpm离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次。调细胞悬液细胞浓度5×106/ml，每份样品取细胞悬液100 μl，加入RNase(0.1 mg/ml)100 μl，37℃溶RNA30 min，PBS洗涤两次，加入PI(0.05 mg/ml，含0.03% TritonX100)0.5 ml，4℃避光反应30 min，FCM检测，激发光源为15 mw氩离子激光，波长488nm。Mad Fit LT软件收集10000个细胞。
1.6 高效液相色谱分析测定松果腺MLT含量 实验动物均于22:00~24:00 h红光下断头处死，立即取出松果腺，每4个松果腺为1个样品，每个样品中加入预冷的0.1 N 高氯酸250 μl 匀浆提取，然后在4000rpm离心15 min，取上清液，放入20℃低温冰箱保存待测[2，3]。
1.7 统计学方法 数据以均数±标准差(x±s),两样本均数比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 电离辐射对松果腺细胞凋亡的影响 昆明小鼠受6.0 GyX射线全身照射后8、48、120、168 h，采用流式细胞术观察照射后细胞凋亡的时效变化，结果表明照射后细胞凋亡百分数增加， 8、48 h显著高于对照组(P<0.01), 48 h达到最高，120、168 h细胞凋亡率降低。
2.2 6.0 Gy X射线照射后不同时间松果腺细胞cAMP含量的变化 6.0 GyX射线全身照射后8、12、48、120、168 h，取松果腺检测cAMP含量的变化，结果表明8、12、48 h随时间增加cAMP含量逐渐降低，48 h达到最低值，120、168 h有所回升，但仍非常显著低于对照组(P<0.01)。
2.3 电离辐射对松果腺细胞中MLT水平的影响 小鼠受6.0 Gy全身照射后8、12、48、120、168 h，经高压液相测量结果表明，照射后8、48、120、168 h松果腺中MLT含量降低，48 h达到最低值。
小鼠受6.0 Gy X线全身照射后不同时间松果腺细胞凋亡及MLT、cAMP含量的变化
3 讨论
松果腺是一个具有多种生理功能的重要神经内分泌器官，在维持机体正常的生理平衡、协调各系统的功能起重要调节作用。松果腺分泌的激素有褪黑素、调节性多肽、催产素、抗利尿激素等，其中褪黑素被认为是松果腺的主要分泌激素，其水平是衡量松果腺功能的重要参数。松果腺分泌褪黑素具有广泛的生理作用，特别是在抗氧化、抗自由基和抗辐射损伤的作用[4]，引起人们的重视。近年来，随着肿瘤放疗技术广泛应用，特别是在头部放疗过程中可能会造成松果腺的损伤，而目前有关高剂量电离辐射对松果腺功能影响的报道资料很少。研究高剂量电离辐射对松果腺功能及其调节作用影响的变化规律和特点，对了解放射损伤整体效应的发生机理和放射损伤的诊治及预防具有重要的理论和实际意义。本实验结果表明：小鼠受6 GyX射线照射后，松果腺分泌和合成MLT明显减少，照射后48 h达到最低。这与国内报道高剂量电离辐射可引起松果腺细胞分泌和合成MLT明显减少相一致[5]。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞的自身主动死亡过程。小鼠受6 GyX射线照射后，松果腺细胞凋亡百分率增加，在照射后48 h达到最大值。cAMP在松果腺信号转导方面起着重要的调节作用，cAMP可激活NAT， NAT是合成MLT的关键酶，通过NAT的活化，进而影响松果腺细胞合成MLT[6]。本实验采用6 GyX射照射小鼠，照射后12，48，120，168 h为时间点，观察cAMP变化，结果发现照射后48 h达到最低。
通过上述实验表明：高剂量电离辐射可引起松果腺细胞合成与分泌MLT功能下降，照射后2 d左右达到最低值。这种功能降低，一方面可能与高剂量照射引起松果腺细胞凋亡明显增高，有功能活性松果腺细胞数减少有关；另一方面可能与高剂量电离辐射引起松果腺细胞中的信号转导功能抑制或降低有关。
参 考 文 献
［1］ 李啸峰，迟宝荣，马琳，等.低剂量电离辐射对松果腺细胞周期的影响.白求恩医科大学学报，2001，27(5)：502503.
［2］ 陈伟，安登魁. 褪黑素的高压液相色谱分析.药理学进展，1997，21(3):164166.
［3］ 李俊，汤晓林，徐叔云.高效液相电化学检测鼠松果腺褪黑素.中国药理学通报,1995，11(6)：520522.
［4］ 徐维平,王维迪.外源性褪黑素对肿瘤辅助治疗效果的Meta分析.中国循证医学杂志,2011,11(6):681686.
［5］ 王枫，张铭.电离辐射对松果腺细胞功能的影响.中华放射医学与防护杂志，2005，25(3):240242.
［6］ 洗励坚.生物节律与时间医学.河南:郑州大学出版社,2003:5658.