关键词 人工肝支持系统 生物型人工肝 非生物型人工肝
急性肝衰竭因肝功能严重受损，导致毒性物质堆积、生理功能紊乱，预后凶险。虽然内科综合治疗近年来取得了不少进展，但病死率仍高达60%～80%。肝移植是目前治疗肝衰竭惟一有效手段。但是由于个体病情和供体缺乏限制了临床使用。人工肝支持系统的研究基于肝细胞强大的再生能力，通过体外机械、理化装置清除体内各种有害物质，代偿肝脏代谢功能，使肝细胞得以再生直至自体肝脏恢复或等待机会进行肝移植，是目前治疗肝衰竭的重要方法之一。由于人工肝以体外支持和功能替代为主，只能取代肝脏的部分功能，因此又被称为人工肝支持系统(ALSS)，简称人工肝。近年来人工肝支持系统，基本形成非生物型人工肝(NBAL)、生物型人工肝(BAL)、混合型生物人工肝(HBALSS)等三大类十几种方法。文章着重对各型人工肝的应用简要综述，并对其发展前景和存在问题进行探讨。
非生物型人工肝
非生物型人工肝以血液透析、血液滤过、血液灌流、血浆置换、连续性血液净化等血液净化技术清除体内毒性物质，维持人体内环境稳定的技术方法。早期非生物型人工肝装置的设计以小分子毒物血液解毒功能为主。到20世纪70年代，随着膜材料与膜技术的发展，血液净化治疗肝病的疗效有所提高。
血浆置换是国内应用最多最广泛的非生物人工肝治疗方法，它依靠血浆交换、交换输血技术，祛除毒性物质、补充生物活性物质。传统的血浆分离器的孔径为0.2～0.6μm，基本上所有的血浆物质都可以透过，在清除毒物的同时丢弃了大量对人体有益的生物活性物质［1］。浙江大学医学院附属第一医院应用小孔径血浆置换器EC-4A治疗重型肝炎患者，和传统的血浆分离器PS-06比较，能保留一部分大分子物质，减少了血浆的用量(EC-4A为2500ml，传统的血浆分离器PS-06为3000ml)。初步结果显示小孔径血浆分离器比传统的血浆分离器更适合应用于血浆置换，维持血流动力稳定，提高疗效［2］。
近年来连续性血液净化技术，以缓慢的血流速度持续稳定进行溶质交换和水分清除，具有血流动力学稳定、有效地祛除细胞因子及炎性介质，可提供充分的营养支持、改善组织氧代谢、持续维持内环境稳定等优点。对于重症肝病患者，尤其是血流动力学不稳定和严重高分解代谢的患者，提供了有效地治疗手段。基于上述原理近年国外研制了一些系统治疗肝衰竭。①分子吸附再循环系统(MARs)：该系统是1993年德国研制的非生物型人工肝系统，基于双面嵌入白蛋白的特殊膜对血液进行透析，血液中分子量＜50000D的中、小分子能够跨膜弥散，膜上的白蛋白的游离位点通过与血浆白蛋白竞争结合亲脂性毒素将白蛋白结合毒素吸附摄取到膜的另一侧，然后依浓度梯度与白蛋白透析液中的白蛋白重新配位结合，同时将毒素转运。白蛋白透析液净化后可循环利用［3］。MARS是非常高效的解毒系统，可部分清除芳香族氨基酸和大量清除白蛋白结合毒素，而机体需要的重要蛋白及激素又得以保留。Heemann等［4］研究指出MARS可以改善多项血清学指标，如降低血清胆红素水平、改善肾功能指标、肝性脑病、瘙痒症状和血流动力学，但同时也指出MARS可以降低患者的短期(30天)病死率，而对60天后的病死率没有影响［5］。由于MARS能有效替代肝脏的解毒功能，纠正血流动力学紊乱，对肝衰竭的并发症和MODS有治疗作用，因此目前临床应用较广泛。②普罗米修斯系统：该系统为费森尤斯公司和多瑙河大学联合研制，使用的Albu-Flow滤器能透过白蛋白，而血细胞和大分子蛋白不能透过，两个吸附装置吸附白蛋白结合毒素，游离的白蛋白能重新进入血液循环。普罗米修斯系统是一个基于血浆分离和吸附以及高通量透析的强大的体外肝脏解毒系统［6］。多项非对照研究均指出，普罗米修斯系统在治疗肝衰竭时，可以显著改善血清结合胆红素、胆汁酸、氨、胆碱酯酶、肌酐、尿素氮以及血pH值水平［7，8］。普罗米修斯系统的机制和疗效与MARS类似，同样可以同时清除蛋白结合毒素和水溶性毒素。但对胆红素和尿素氮的清除，普罗米修斯系统优于MARS系统，两者对胆汁酸的清除能力相当，而MARS系统可以改善患者的循环状态［9，10］。非生物型侧重于代偿肝脏的解毒作用，其不能完全替代肝脏的合成、代谢功能。
生物型人工肝
生物型人工肝是利用人或动物的肝组织匀浆、分离的肝细胞、肝脏切片或全肝等与生物合成材料相结合的体外装置，主要由肝细胞来源、细胞培养方式和生物反应器三要素构成。
细胞来源：①肝细胞：生物型人工肝应用系统的成功很大程度上取决于肝细胞的功能性和稳定性。由于人肝细胞功能性好，细胞生物学功能相同，特别是能够提供同源的生物活性物质，如白蛋白、肝细胞再生因子、凝血因子等，是生物人工肝支持系统最理想的细胞材料，这些都是其他细胞材料不具备的优点。Wurm等使用小型人肝细胞为BAL装置建立了一种独立操作的灌注旋转细胞培养系统，各种功能检测结果表明这种装置作为移植桥梁是可行的［3，11］。但人原代肝细胞体外培养生长条件苛刻、存活时间有限、增殖传代困难，并受到捐献器官短缺的限制，所以许多学者都转向异种肝细胞。Poyck等比较了成年猪肝细胞(MPHs)和成人肝细胞(MHHs)的功能和代谢能力，认为MHHs高除氨能力和代谢稳定性使其成为BAL装置最佳的细胞来源［4］。但是由于猪内源性逆转录病毒(PERV)基因组存在于所有猪细胞中，一直以来成为应用的最大顾虑。Fruhauf等证实了在BAL中，原代MPHs能将PERV转移给原代人肝细胞、人HEK293细胞系及内皮细胞，且这种传染性在短时间接触下就能发生［5］。尽管如此，还是有许多学者对MPHs的研究给予强烈关注。②肝细胞株：由于人肝细胞或动物的原代肝细胞，存在对体外培养生长条件要求严格、存活时间有限、难以传代等缺点。永生化的肝细胞株具有容易培养，无限生长、细胞间无接触抑制、培养后能迅速达到数量要求、取之不尽等特点，所以采用肝细胞株作为生物人工肝的细胞材料备受关注。它包括C3A、HepG2等细胞系［5］。Poyck等评估了人胎儿肝细胞系cBAL111在BAL中的应用，得出cBAL111具有肝特异性功能，除氨能力主要通过谷氨酰胺酶的作用而非尿素循环［7］。包括肝肿瘤细胞株、用生化人肝细胞株、可恢复永生化肝细胞株、猪肝细胞株。但是由于肝衰竭患者免疫功能低下，清除恶性细胞的能力降低，肝细胞株的代谢功能相对较低，永生化细胞的转移以及肿瘤基因产物的释放入血等都使其临床应用顾虑重重［8］。③肝干细胞：人干细胞主要分为肝源性肝干细胞、非肝源性肝干细胞。肝源性肝干细胞来源于前肠内胚层，在胚胎发育过程中以成肝细胞的形式存在，在成年哺乳动物肝内以卵圆细胞形式存在［12］。肝源性干细胞通过提高直接氧合作用、限定生物相容性微支架、器官特异性细胞模型、动态培养、细胞内外代谢状态来模拟体内肝微环境，从而为BAL装置开辟新的途径［13］。简国登等研究发现，来源于正常肝组织的CL-1细胞，恶性程度较低，分化较好，利用二次分浆技术，能够有效防止生物反应器内肝细胞漏入患者体内，能够有效防止生物反应器内肝细胞漏入患者体内，提示CL-1细胞在目前生物人工肝的细胞材料来源有限的情况下，不失为一种经济安全的种子细胞来源［14］。间充质组织具有基质细胞的多系分化能力，间充质干细胞(MSCs)在不同环境中能分化为不同种类的细胞，具有干细胞的共性。Kang等利用成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)和肝细胞生长因子(HGF)诱导人脐带血源性MSCs分化成肝细胞，从而为肝脏疾病的细胞移植治疗提供新型来源［15］。
细胞培养：目前常用的肝细胞培养方法主要是共培养、微囊化培养、球形体聚集培养和生物反应器培养等。事实共培养、微囊化培养、球形培养和生物反应器培养可以联合应用，有研究表明，肝细胞与其他细胞共同微囊化培养比单独微囊化细胞存活时间更长［16］。
生物反应器：生物反应器是生物人工肝的核心部分，肝功能的发挥是在生物反应器中进行的。现已研发出几种新的反应器有很多种，如模块式体外人工肝系统(MELS)﹑全血灌注生物型人工肝﹑Innsbruck)﹑多层PDMS(聚二甲基硅氧烷)生物反应器(MLO)、平板生物反应器﹑微槽物生物反应器等。人工肝反应器设计上，细胞体积分布分数、细胞剪应力、氧压值是最终所关注的重要参数。经过大量的研究得出，肝细胞剪应力的阈值为0.5Pa，而细胞内氧分压的阈值为10mmHg。即剪应力应低于0.5Pa，而氧分压要高于10mmHg，才能保证细胞存活。在贴壁培养时还要考虑细胞支架对流场的影响，在供氧不足时可采用加多供氧毛细管数目的方法达到提高供氧［17］。
混合型人工肝
单纯靠生物型人工肝脏支持治疗后能存活的病例多为个案报道，病例数较少。混合型人工肝则结合了生物及非生物型人工肝优点从理论上讲可以代偿肝脏的全部功能。故而，HAL已经成为人工肝领域新的研究热点。目前研发出来的HAL系统有如下几种。
HepatAssist2000肝脏支持系统：是由Baylar设计，Vital治疗公司(San Diego，CA，USA)研制开发的。它是到目前为止唯一采用人肝细胞株(HepC3A)的人工肝装置，由4个中空纤维型生物反应器并联而成［15，16］。HepatAssist2000目前已完成了多中心Ⅲ期临床试验，该系统在改善患者神经系统方面的作用是肯定的［18］。
ELAD体外肝辅助装置(ELAD)：是由Baylar设计，Vital治疗公司(San Diego，CA，USA)研制开发的。它是到目前为止唯一采用人肝细胞株(HepC3A)的人工肝装置，由4个中空纤维型生物反应器并联而成［11］。
HepatAssist系统：HepatAssist生物人工肝系统是目前唯一完成Ⅱ/Ⅲ期前瞻性的多中心、随机、对照临床试验的生物人工肝系统［16，17］，已进行了Ⅱ/Ⅲ期临床试验［11］。
HALSS混合型人工肝支持系统(HALSS)：混合型人工肝支持系统(HALSS)是浙江大学医学院附属第一医院李兰娟等研制的一种混合型生物人工肝，它同样是采用猪肝细胞作为细胞来源，细胞总量为5×109，细胞接种于中空纤维型的生物反应器中血浆分离器分离后的患者血浆流经中空纤维管的内管腔，患者血浆与猪肝细胞通过中空纤维管半透膜进行物质交换，实现肝脏支持功能。整个系统配备保温、蠕动泵、速度控制等装置。李兰娟等［19］用该混合人工肝治疗了15例慢性重型病毒性肝炎患者，结果发现，每次治疗后患者临床症状不同程度减轻，乏力、腹胀明显改善，腹水减少。
展 望
随着人工肝治疗研究的不断深入以及相关交叉学科的快速发展，如细胞生物技术、生物材料的发展，必能带动在细胞源和生物反应器等方面取得突破，人工肝的性能也必然会不断地改进与优化，同时合理地将非生物人工肝和生物活性成分相结合，构建出高效而完善的混合型生物人工肝，提高肝衰竭患者的治疗效果。我们有理由相信关于人工肝治疗肝衰竭方面的研究可能会在不久的将来取得突破性进展。
参考文献
1 车龙,牛殿吉,金福东,等.血浆吸附治疗高胆红素血症临床观察［J］.中国危重病急救医学,2006,18(1):12.
2 陈滟珊,李兰娟.生物人工肝研究进展［J］.国际流行病学传染病学杂志,2006,(33)4:243-246.
3 Wurm M,Lubei V,Caronna M,et al.Introduceion of a novel prototype bioartificial liver support system utilizing small human hepatocytes in rotary culture［J］.Tissue Eng Part A,2009,15:1063-1073.
4 Poyck PP,Hoekstra R,van Wijk AC,et al.Functional and morphological comparison of three primary liver cell types cul-tured in the AMC bioartificial liver［J］.Liver Transpl,2007,13:589-298.
5 Kinasiewicz A,Gautier A,Lewinska D,et al.Culture of C3A cells in alginate beads for fluidized bed bioartificial liver ［J］.Transplant Proc,2007,39:2911-2913.
6 Rifai K,Ernst T,Kretschmer U,et al.Prometheus-a new extracorporeal system for the treatment of liver failure［J］.J Hepatol,2003,39:984.
7 Poyck PP,van Wijk AC,van der Hoeven TV,et al.Evalu-ation of a new immortalized human fetal liver cell line(cBAL111)for application in bioartificial liver［J］.J Hepa-tol,2008,48:189-191.
8 Elkayam T,Amitay-ShaPrut S,Dvir-Ginzberg M,et al.Enhancing the Drug Metabolism Activities of C3A-A Human HePatoeyte Cell Line By Tissue Engineering With in Alginate Saffolds［J］.Tissue Engineering,2006,12(5):13573-1368.
9 Krisper P,Haditsch B,Stauber R,et al.In vivo quantification of liver dialysis:comparison of albumin dialysis and fractionated plasma separation［J］.J Hepatol,2005,43:451.
10 Laleman W,Wilmer A,Evenepoel P,et al.Effect of the molecular adsorbent recirculating system and Prometheus devices on systemic haemodynamics and vasoactive agents in patients with acute-on-chronic alcoholic liver failure［J］.Crit Care,2006,10:R108.
11 Demetriou AA,Brown RSJ,Busuttil RW,et al.Prospective,randomized,multicenter,controlled trial of abioartificial liver in treating acute liver failure［J］.Ann Surg,2004,239(5):660-670.
12 Sato N,Meijer L,Skaltsounis L,et al.Maintenanee of PluriPoteney in human and Mouse embryonie stem cells through aetivation of Wnt signaling by a Pharmaeological GSK-3 specifie inhibitor［J］.Nat Med,2004,10:55-63.
13 Giri S,Bader A.Improved preclinical safety assessment usingmicro-BAL devices:the potential impact on human discovery and drug attrition［J］.Drug Discov Today,2011,16:382-397.
14 简国登.新型人源细胞混合型生物人工肝的安全性［J］.中国组织工程研究与临床康复,2010,19(3):2129-2132.
15 Kang XQ,Zang WJ,Bao LJ,et al.Fibroblast growth fac-tor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cellsinto hepatocytes［J］.World J Gastroenterol,2005,11:7461-7465.
16 liu Z,Chang TM.Effects of bone marrow cells on hepato-cytes:when co-cultured or co-encapsulated together ［J］.Ar-tif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol,2000,28:365-374.
17 霍小林.人工肝生物反应器优化设计的仿真研究进展［J］.临床肝胆病杂志,2010,26(6):577-580.
18 RozgaJ.Liversupporttechnology-anupdate［J］.Xenotran-splantation,2006,13(5):380-389.
19 余松林.生物人工肝的研究与进展［J］.中国组织工程研究与临床康复,2009,9(13):10513-10516.