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摘 要 以醛基修饰的载玻片为固相载体，农药竞争抗原为包被抗原，胶体金为标记材料，抗农药单克隆抗体为识别元件，银增强试剂用于放大信号，建立了一种含有10对包被抗原与农药抗体组合的免疫芯片，可同时检测农产品中毒死蜱、三唑磷、克百威、噻虫啉、吡虫啉、多菌灵、异菌脲、涕灭威、甲氰菊酯和百菌清共10种农药。对胶体金标记探针、包被抗原与农药抗体组合等免疫芯片反应条件進行了优化。本方法对10种农药的检出限（IC20）达到1.49～15.72 μg/L，检测仅需1.5 h。将此芯片方法应用于水果（苹果）、蔬菜（黄瓜）以及茶叶（红茶）中的10种农药残留检测，其最低检出量可满足相应作物中的农药最大残留限量（MRL）检测要求，且此芯片检测方法具有较高的准确度和精密度，农药的添加回收率为82.1%～120.8%，批内相对标准偏差RSD≤10.4%， 批间RSD≤12.1%，与质谱仪检测结果的相关系数大于0.9591。本研究为农药多残留快速检测分析提供了技术支持，具有良好的实用价值。
关键词 农药多残留; 快速检测; 免疫芯片; 胶体金; 竞争反应
1 引 言
发展食品中农药残留的检测技术，对保障食品安全和消费者健康、保护生态环境具有非常重要的意义。常用的农药残留检测技术为色谱法、质谱法等仪器方法[1～6]，准确率高，可实现定性与定量分析，但其耗时长、检测成本高，对检测人员技能要求高，而农药残留快速检测技术可以弥补这些不足。常见农药残留快速检测方法包括酶抑制法和免疫分析方法。其中，酶抑制法已列入国家标准，但其检测对象仅限于有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂，这两类农药在农业生产中已较少使用，因而存在一定的局限性。免疫分析方法主要基于抗原抗体反应，其检测的农药范围比酶抑制法更宽，检测快速，特异性强，灵敏度高。
常见的免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫侧流层析试纸法。Liu等[7]建立了间接竞争性ELISA定量检测果蔬中苯醚甲环唑的方法，最低检出量达229 μg/kg; Ma等[8]建立了ELISA法检测蜂蜜样品中的吡虫啉和噻虫嗪残留，最低检出量为20 μg/kg 和5 μg/kg; Chen等[9]建立了量子点-链霉亲和素偶联物快速灵敏竞争荧光ELISA方法，用于饮用水中毒死蜱检测，灵敏度较常规ELISA提高了5.5倍。对于ELISA法，一种试剂盒通常只能检测一种或两种农药。随着胶体金、量子点、荧光微球等多种纳米材料被适为标记物，试纸免疫侧流层析法在农药残留检测中的应用研究日益增多[10]。Liu等[11]将胶体金试纸技术， 用于三唑磷和对硫磷农药检测，检测灵敏度分别为50和100 μg/L; Wang等[12]将量子点试纸技术应用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺农药检测，检出限为0.10～0.33 μg/L; Zhang等[13]将时间分辨免疫层析技术用于检测克百威，检出限达0.04～0.76 μg/L。虽然免疫层析试纸的制备成本低，便于携带，现场检测方便，但由于其空间局限性，一条试纸不易设置5条以上的测试线[14]，故一般检测农药的种类小于5种[15]。因此，亟需研发能实现更多种农药残留同时快速定性与定量检测的分析方法。
免疫芯片是以抗原-抗体特异性结合反应为基础的蛋白芯片，是将几个、几十个甚至更高通量的抗原或抗体微量化， 以点阵式高密度排列于载体芯片，通过特异性免疫反应捕获待测样品中的靶分子，检测靶分子的含量[16]。免疫芯片技术已应用于生物医学的疾病诊断、蛋白质功能鉴定、微生物致病菌鉴定方面，并逐渐拓展到环境监测、食品卫生与质量安全控制等方面[17]。近年来，免疫芯片技术已被用于小分子污染物的检测中，主要采用固定包被抗原的竞争免疫反应模式，使用的芯片载体有琼脂糖玻片、醋酸纤维膜和CD光盘，检测对象有兽药[18]、真菌毒素[19]、农药[20，21]等，但目标测试物通常不超过10种，且大都局限于环境水样的检测，尚未将免疫芯片技术应用于畜产品、农产品等复杂基质样本。 这可能是由于复杂样品基质对不同抗原-抗体反应的干扰程度不同，当多个免疫反应同时在均相统一的体系条件下进行，会影响个别反应的灵敏度，或者部分抗原-抗体有交叉识别现象。因此，目前关于农产品基质中农药多残留检测免疫芯片技术的报道较少。本课题组前期建立的基于金增强的间接竞争免疫芯片技术用于检测蔬果中呋喃丹等7种农药[22]，采用QuEChERS方法进行样品提取与净化，从而降低基质干扰，但该研究采用硝酸纤维膜为非共价结合吸附载体，包被抗原固定程度易受反应体系（如pH值、盐离子强度）的影响，且漂洗过程存在膜易破损、不便操作等缺点。
本研究选择玻片为载体，在其表面进行醛基修饰，将包被抗原以共价键结合固定于载体上，更加稳定，并建立了毒死蜱等10种常见农药多残留的免疫芯片检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）; PHS-3C pH计（上海雷磁环保工程公司）; Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）; Allegra 64R台式高速离心机（美国Beckman公司）; GB500-X芯片点样仪（爱尔兰PolyPico Technologies公司）; 图像扫描仪（日本EPSON公司）; Analysis Only 4100芯片数据分析软件（美国GenePix Pro公司）; Agilent 7000C气相色谱串联质谱仪（GC-MS/MS，美国Agilent公司）; 超高效液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS，美国Waters公司）。
氯金酸、柠檬酸三钠、N-羟基丁二酰亚胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亚胺、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、银增强液A和银增强液B、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、邻苯二胺（OPD）、N-丙基乙二胺（PSA） （美国Sigma-Aldrich公司），其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂公司）。脱脂奶粉（上海光明乳业公司）; 8 mg/mL羊抗鼠IgG（二抗，上海捷宁生物公司）; 琼脂糖（北京Solarbio公司）; 芯片围栏（北京博奥生物公司）; 载玻片（浙江同力信息科技公司）。实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）。